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- 產(chǎn)品名稱(chēng)： 熒光素Fluor680標記試劑盒
- 產(chǎn)品貨號： CSL0580
- 貨期： 現貨
- 價(jià)格與訂購： 2800
- 數量：
庫存： 100
- 規格： 一盒
- 產(chǎn)品信息
- 如何訂購
Fluor熒光染料為活性熒光染料，該系列包括從紫外、可見(jiàn)光譜到近紅外光譜常見(jiàn)熒光染料，用于標記生物分子，特別是蛋白質(zhì)和核酸。對核心結構的創(chuàng )新性修改使得Fluor染料優(yōu)于具有許多創(chuàng )新新穎特征的其他商業(yè)染料，主要表現在標記效率更高，發(fā)光度更強。
Fluor680是一種熒光染料，其激發(fā)波長(cháng)和發(fā)射波長(cháng)分別為683nm和700nm，它與抗體形成更特異的抗體熒光素結合物，背景較更低。cy5.5升級產(chǎn)品。
基本原理
本試劑盒主要通過(guò)熒光素集團的活性鍵與生物分子的游離氨基共價(jià)結合，可以用于標記抗體，蛋白。本試劑盒種所提供的熒光染料都為預先活化干粉，便于長(cháng)期保存，使用時(shí)用試劑盒隨帶的DMSO溶解便可直接用于標記實(shí)驗，60-90分鐘可以輕松完成標記。標記產(chǎn)物在含有防腐劑的保存液中可以放置在 4?C至少保存1個(gè)月以上，需要長(cháng)期保存。
本試劑盒常被用于抗體的直接標記，省卻了二抗的使用和其所帶來(lái)的操作步驟。
試劑盒組分
| 組分名稱(chēng)（Components） | 型號規格及其對應組分 | |||
| ARL0580K-200 | ARL0580K-500 | ARL0580K-1000 |
其他規格可洽定制 | |
| 可標記抗體量 | 0.2~1.0mg | 0.5~2.5mg | 1.0~5.0mg | |
| 活化Fluor680干粉 | 使用時(shí)加DMSO 40ul溶解 | 使用時(shí)加DMSO 100ul溶解 | 使用時(shí)加DMSO 200ul溶解 | |
| DMSO | 40ul | 100ul | 200ul | |
| 標記緩沖液(Coupling buffer) | 10mL | 15mL | 30mL | |
| 標記物保存液(Preservation Buffer) | 2.0mL | 2mL*2 | 10mL | |
| 純化超濾管: | 1支 | 1支 | 1支 | |
重要提示：
1. 本試劑盒所配置的活化Fluor680熒光染料為干粉，可放置4?C或者-20?C長(cháng)期保存，使用時(shí)加入試劑盒所配的DMSO溶解即可用于標記，溶解后的Fluor680熒光染料不可保存下次使用，建議一次性使用完；
2. 本試劑盒所配置的超濾管默認截留30k MWCO,適合于抗體抗體，如果需要標記其他分子量蛋白類(lèi)物質(zhì)請與我們聯(lián)系，給您配置相應分子量截留超濾管（您的待標記物質(zhì)分子量必須大于超濾管截留分子量的2倍以上）；
3. 本試劑盒所推薦的抗體標記量?jì)H供參考，如有更高要求需要實(shí)驗者具體摸索優(yōu)化，建議按照推薦最低量進(jìn)行標記實(shí)驗。
4. 對待標記抗體、蛋白質(zhì)的要求：
ü 待標記物以0.01M pH7.4 PBS環(huán)境為佳，不應含有甘油、BSA、疊氮鈉、氨基物質(zhì)（包括甘氨酸、Tris 等），EDTA等物質(zhì)。如果含有以上小分子物質(zhì)，需用0.01M pH7.4 PBS 緩沖溶液進(jìn)行充分透析、脫鹽柱脫鹽或者超濾管超濾置換溶液以除去干擾小分子，如果含有保護性蛋白BSA等需要想辦法將其分離去除；
ü 調整待標記物至適當的濃度，抗體調整的濃度為2-10mg/mL為宜；對于小分子物質(zhì)需要實(shí)驗者摸索濃度，保證熒光素的比例過(guò)量。
ü 最佳標記反應條件為試劑盒所提供的標記緩沖液環(huán)境，盡可能在標記前將待標記物溶液環(huán)境置換為標記還緩沖液；
ü 如果待標記物溶液中有不溶物、有塊狀物或者沉淀請離心或者過(guò)濾除掉。
其他需要自備材料：
ü 待標記的生物分子
ü 移液器及吸頭.
ü 去離子水.
ü PBS (pH 7.4)
試劑盒儲存
試劑盒放在-20?C可保存6個(gè)月以上。.
常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法
Q: 待標記分子經(jīng)過(guò)濃縮濃度仍然達不到2 mg/ml，再濃縮就產(chǎn)生沉淀了怎么辦?
A: 標記的時(shí)候盡可能達到這個(gè)濃度，如果實(shí)在達不到這個(gè)濃度，適當增加加入的活化的熒光素的量；最佳標記效果可以梯度增加熒光素用量試驗測試來(lái)確定。
Q: 待標記分子與熒光素的最佳摩爾比只能是1:8 - 1:22之間？
A: 這個(gè)要根據不同生物分子性質(zhì)確定，更準確的說(shuō)與生物分子表面氨基個(gè)數有關(guān)系；最佳標記比例可根據梯度用量測試確定。
Q: 如果選擇標記試劑盒中的超濾管型號?
A: 一般來(lái)說(shuō)，您待標記生物分子的分子量是超濾管截留分子量的2倍以上最好；比如，標記抗體，抗體分子量為150Kd,選擇分子截留75kD以下的都可以，分子量截留越小，超濾越慢。如果分子量太小，標記完以后建議用更高精度的純化方式，比如，10kD分子量建議用HPLC純化
試劑盒使用操作流程
? 試劑準備
待標記的生物分子與熒光素最佳摩爾比例為1:8-1:22,本試劑盒推薦最佳比例為1:15（按照本試劑盒操作熒光素干粉加入相應量DMSO溶解后的熒光素濃度770uM(nmol/ml),通常1mg/ml抗體(分子量150kDa)的濃度為6.67uM(nmol/ml)； 為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過(guò)預實(shí)驗進(jìn)行摸索。以抗體標記為例，推薦量如下。最佳標記體系應保證抗體的濃度為2mg/ml，標記時(shí)終濃度不低于1mg/ml。對于其他標記量，參照表按等比例調整抗體的體積和用量。
? 樣品準備
待標記的分子濃度不低于2 mg/ml，如果濃度較低，需在實(shí)驗之前濃縮到2mg/ml以上；待標記的分子需要溶解在符合以下要求的緩沖液中，如果符合以下要求可以直接進(jìn)行標記，如果不符合請將溶液置換（透析或者超濾）到符合要求的溶液中在進(jìn)行標記實(shí)驗。
| pH | 6.5-8.0 |
| 不含游離氨基 | MES, PBS, HEPES |
| 螯合劑 (e.g. EDTA) | ü |
| 甘油 | < 5% |
| 牛血清白蛋白 | ? |
| 甘氨酸 | ? |
| 含氨基組分 | ? |
? 操作流程(以標記100ug抗體為例,2mg/ml)
1) 將待標記抗體溶液置換成標記緩沖液，或者加入1/10體積標記緩沖液，用移液器輕輕混勻；
2) 取20ul(按照抗體與熒光素摩爾比=1:23)活化的Fluor680溶液加入到上述步驟混勻的抗體中，輕輕混勻，37℃ 避光反應1小時(shí)；
3) 反應完畢，將適量的PBS（約450uL）加入到步驟2)的混合溶液中，輕輕混勻并將溶液移至超濾管芯，4℃ 12000離心5min；
4) 離心完畢，取出管芯將外套管內溶液棄掉，管芯重新插入外套管，在管芯內重新加入適量的PBS（約450uL）4℃ 12000離心5min；
5) 重復步驟4）5次以上；
6) 將超濾管芯內溶液輕輕混勻并吹打管心內壁，并轉移到干凈避光離心管，此即為熒光素標記產(chǎn)物。
? 標記產(chǎn)物的保存
根據實(shí)驗需要調整到合適的濃度，可加入適量BSA，甘油及防腐劑等，分裝成小分-20℃避光保存；也可以將試劑盒附帶的標記物保存液與標記產(chǎn)物按照體積比1：1混勻后，即可分裝保存。
Flour 680標記蛋白F/P值計算：
1）用PBS 精確倍數稀釋定量的少許純化過(guò)的偶聯(lián)蛋白，在1cm比色皿中測定280nm和680nm的光吸收；
2）計算樣品中的蛋白濃度：蛋白摩爾濃度=(A280-(A650×0.05))×稀釋倍數/203000
3）計算標記比例： 每摩爾蛋白結合的染料摩爾數=A650×稀釋倍數/(184000×蛋白摩爾濃度)
常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法
Q: 待標記分子經(jīng)過(guò)濃縮濃度仍然達不到2 mg/ml，再濃縮就產(chǎn)生沉淀了怎么辦?
A: 標記的時(shí)候盡可能達到這個(gè)濃度，如果實(shí)在達不到這個(gè)濃度，適當增加加入的活化的熒光素的量；最佳標記效果可以梯度增加熒光素用量試驗測試來(lái)確定。
Q: 待標記分子與熒光素的最佳摩爾比只能是1:8 - 1:22之間？
A: 這個(gè)要根據不同生物分子性質(zhì)確定，更準確的說(shuō)與生物分子表面氨基個(gè)數有關(guān)系；最佳標記比例可根據梯度用量測試確定。
Q: 如果選擇標記試劑盒中的超濾管型號?
A: 一般來(lái)說(shuō)，您待標記生物分子的分子量是超濾管截留分子量的2倍以上最好；比如，標記抗體，抗體分子量為150Kd,選擇分子截留75kD以下的都可以，分子量截留越小，超濾越慢。如果分子量太小，標記完以后建議用更高精度的純化方式，比如，10kD分子量建議用HPLC純化
Q:標記效率低
A:有以下原因：
1）緩沖液中含有痕量伯銨成分，與染料反應降低了標記效率。如果蛋白已經(jīng)溶于含氨基的緩沖液（如Tris或氨基乙酸），標記前用PBS透析。
2）蛋白含量較低 (≤1 mg/mL)會(huì )影響標記效率。
3）標記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應混合物的pH升高至～8，因為在弱堿性環(huán)境中標記反應的效率最高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH，加入重碳酸鹽也無(wú)法將pH調節至最適水平。要么加大重碳酸鹽的量，要么將緩沖液換成PBS，或用0.1 M碳酸氫鈉透析等。
4）研究顯示pH升至9.0～9.4，標記效率和標記速度（只需10min）明顯改善。
5）不同抗體與熒光團的反應速率不同，染料標記后保留的生物活性程度也不同，因此標準步驟也不是總有最好的標記結果。為增加標記率，可以對同一樣品進(jìn)行再標記，或減少蛋白的量加大染料的量重新標記。有研究者在室溫孵育1小時(shí)后再4℃孵育過(guò)夜，情況有所改善。
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